Electropherogram DNA Sequencing, Pengantar

Teknologi DNA sequencing adalah teknologi penentuan urutan basa DNA. Dan Metode Elektroforesis adalah teknik umum yg digunakan dalam proses pemindaian urutan basa pada struktur double helix ini. Elektroforesis mendasarkan proses pd prinsip pemisahan molekul seluler berdasarkan atas ukurannya yaitu dgn memanfaatkan medan listrik yg dialirkan pada suatu medium yg mengandung sampel yg akan dipisahkan. Muatan listrik pada molekul mendorong molekul bergerak dr satu kutub negatif menuju ke kutub positif, dan kecepatan geraknya tergantung pada ratio muatan terhadap massanya serta tergantung juga pada bentuk molekulnya. Setelah beberapa waktu, dilakukan perendaman dalam larutan etidium bromida yg akan menginterkalasi DNA. Fungsi etidium bromida ini adalah untk membantu visualisasi, karena etidium bromida akan memendarkan sinar UV. Jika gel disinari dg UV dr bawah, maka akan tampak citra berupa pita2 pada gel yg merupakan molekul2 DNA yg bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis. Teknik DNA sequencing yg umum ini termasuk Dye-terminator sequencing, di mana output alat sequencernya berupa 'peak-peak' yg terdiri dari 4 warna; hijau utk Adenine (A), merah utk Thymine (T), biru utk Cytosine (C), dan hitam utk Guanine (G). Peak inilah yg dinamakan Elektropherogram. Komputer DNA sequencer telah meng-call elektropherogram secara otomatis menjadi urutan basa-basa nukleotida. Namun ada kalanya program komputer mengalami kesalahan/kegagalan interpretasi pada elektropherogram yg bermasalah shg urutan basa nukleotida yg dihasilkan bisa salah dan ini mempengaruhi hasil penelitian dan analisa lanjutan yg akan dilakukan thd hasil sequencing tsb. Oleh karena itu mutlak adanya interpretasi manual menggunakan 'mata kepala sendiri' untk mencari peak2 yg ambigu dan membuang bagian elektropherogram yg terlalu banyak eror. Ciri elektropherogram yg bersih adalah sbb: 1. Jarak atau spasi antar peak yg sama. 2. Setiap peak terdiri dr hanya satu warna. 3. Ketinggian peak bervariasi hingga beda 3x lipat antara peak tertinggi dgn terendah 4. Jika terdapat peak 'noise' pada baseline, selama kualitas template dan primernya bagus, maka noise ini dianggap sangat minim dan tidak berpengaruh secara signifikan terhadap pembacaan